1853年，美國東印度艦隊司令官彼理（ペリー，又作伯理），率艦航抵浦賀外海，欲以日本港口作為捕鯨船補給基地，要求日本開國。以其軍艦色黑，史稱「黑船來航」事件。翌年彼理再度來航，與幕府簽定《日美和親條約》。1858年，美國下田總領事哈利斯〔ハリス〕抵日，又迫幕府簽定《日美修好通商條約》。
大老井伊直弼，在未取得朝廷許可的情況下擅自簽約，引起尊攘派反感，加上在將軍繼承之爭中，尊攘派之首水戶藩藩主德川齊昭支持其子慶喜，而井伊直弼卻讓德川慶福（即家茂）繼任，雙方嫌隙加深。其後天皇私下密詔給水戶藩，此舉無異於朝廷繞過幕府干政，井伊直弼聞知後大怒，下令抓捕相關人等，興起大獄，史稱「安政大獄」。水戶藩德川齊昭被處永久軟禁（永蟄居），德川慶篤則被禁止登城。開辦松下村塾的吉田松陰亦於此時遭處斬。
水戶藩藩士為報主家之仇，脫藩湧向江戶，埋伏於櫻田門外，迨井伊直弼乘轎前往江戶城途中，將之刺殺，史稱「櫻田門外之變」。此後，尊攘派勢力大興，以「天誅」之名，隨意暗殺佐幕派人士。尤其是岡田以藏、田中新兵衛、河上彥齋、中村半次郎等人，史稱幕末四大人斬。
當時幕府因尊攘派勢力重振，認為有必要及早實現「公武合體」，亦即讓公家（朝廷）與武家（幕府）合作，以反制倒幕思想。此論不僅天皇認可，尊攘派各藩藩主亦多表贊同。1862年3月，孝明天皇將其妹和宮，下嫁給將軍德川家茂。
1862年5月，有馬新七等薩摩藩激進倒幕派，潛伏於京都寺田屋，計畫刺殺關白九條尚忠、京都所司代酒井忠義。然而當時薩摩藩藩主島津久光，正在推動公武合體，並無倒幕之意，在得知此事後，隨即對藩內下令前去討伐，史稱「寺田屋事件」。藩主島津久光因此事而威信大增，未幾便受命隨朝廷敕使前往江戶，商討公武合體事宜。
同年9月，島津久光自江戶回藩途中，行經生麥村，遇英國人穿行其隊伍，遭薩摩藩藩士斬殺，史稱「生麥事件」。雖然幕府已就此事向英國支付賠償金，但英國也向薩摩藩要求賠償，藩主島津久光拒絕，英國艦隊遂對鹿兒島施以砲擊。最後，薩摩藩向幕府借錢賠款，薩英雙方講和，同時也開始合作，向英國引入新式軍備。大久保利通等薩摩藩尊攘派，亦大受刺激，逐漸轉而支持開國。
1863年，將軍家茂即將上洛面見天皇，共商攘夷，然而當時的京都，充斥尊攘派的「天誅」行動。為保安全，乃由清河八郎招募一批浪人，成立浪士組，先行前去協助維護京都治安。不料到了京都後，清河八郎卻改口說是要尊王攘夷，甚至上書朝廷，表明浪士組要為朝廷效力。幕府得知消息後，立即下令浪士組撤回江戶，最終僅餘近藤勇、芹澤鴨等人，仍欲留在京都保護將軍。之後，時任京都守護職的會津藩藩主松平容保，將之收編，成立新選組，旨在對付尊攘派，維護京都治安。
同年9月，尊攘派公家與長州藩志士聯手，計畫讓孝明天皇行幸大和，藉以遠離幕府監視，進而挾天子以令諸候，迫令幕府攘夷，若幕府拒絕，也可藉此名義推翻幕府。然而，孝明天皇並無倒幕之意，亦不願受制於人。公武合體派的皇族、公家等人，聯合時任京都守護職的會津藩，以及與長州敵對的薩摩藩，於9月30日（舊曆八月十八日）凌晨突襲，將長州藩兵趕出御所，同時守住大門，不讓尊攘派公家入內。長州藩只得離京回藩，同時也護送三條實美等七名激進派公卿同行。
1864年，以長州為中心的尊攘志士，打算在京都放火，再乘亂暗殺幕府要人，甚至定出大膽計畫，欲將天皇移往長州。然而，負責聯絡的古高俊太郎，遭新選組逮捕，計畫因而曝光。其後，參與行動的志士等人，集會於京都池田屋，遭新選組襲擊，吉田稔麿、宮部鼎藏等人皆命喪於此，桂小五郎則僥倖脫逃。
長州藩因八月十八日政變而遭逐出京都，又逢池田屋之變，一怒之下，拜來島又兵衛為總大將，出兵京都。最終在諸藩抵禦下，來島又兵衛戰死，長州軍敗退，史稱「禁門之變」，又名「蛤御門之變」。
隨後，天皇下詔征討反賊長州藩，幕府拜尾張藩前藩主德川慶勝為征長總督，以西鄉隆盛為參謀，集各藩之兵往討長州。然而西鄉隆盛不願置長州於死地，主張採行分化策略。而主張攘夷的長州藩，曾於去年（1863年）對通行馬關海峽的外國船隻無預警發砲，封鎖海峽，引來英、法、荷、美四國船艦，於1864年聯手回擊，長州沿海砲臺悉數被毀。武力攘夷不成，藩內保守派得勢，將禁門之變禍首等人處斬，向幕府表達恭順之意。於是幕府未戰而罷兵。是為第一次征伐長州之役。
元治元年（1864年）末至慶應元年（1865年）初，高杉晉作等人於馬關（下關）舉兵，奪取長州藩主導權，以奇兵隊等武力為後盾，將藩論導向與幕府軍事對決。幕府以其密謀不軌，加之私下與外國交易，於是奏請再伐長州，於1865年9月，獲天皇批准。惟朝廷內部及各藩之中，多有反對再次征伐之聲，薩摩藩更是表明拒絕出兵。1866年6月，幕府軍與長州軍正式開戰。此前，長州藩已在坂本龍馬、中岡慎太郎等人斡旋下，於1866年1月與薩摩藩結為同盟，藩內由高杉晉作與桂小五郎等人，鞏固全藩軍事體制，有效利用各部隊與農商之兵，且走私進口近現代兵器，而幕府方面，卻因大坂、江戶爆發打砸搶等暴亂及農民暴動而腹背受敵，戰況十分不利。1866年8月，將軍家茂病逝於大坂城，幕府藉此停戰。年底又適孝明天皇逝世，幕府再取得解兵詔書，宣告撤兵。是為第二次征伐長州之役。此役過後，幕府威信盡失。
1867年11月，末代將軍德川慶喜，有感於薩長同盟之威脅，主動表明願辭去征夷大將軍一職，將政權歸還朝廷，使薩長等藩無討幕理由，且政權雖歸還朝廷，自己仍能進入新政府擔任議長。
1868年1月，朝廷下達王政復古大號令，宣告廢止江戶幕府，成立以天皇為首的新政府，同時要求德川慶喜「辭官納地」，要他交出天領（幕府直轄地）。德川慶喜大為不滿，加以西鄉隆盛刻意挑釁，兩造遂爆發鳥羽伏見之戰，幕府軍戰敗，德川慶喜逃回江戶。新政府將德川慶喜、會津藩藩主松平容保、桑名藩藩主松平定敬等人列為朝敵，下達討伐令，發兵江戶。幕府見大勢已去，以勝海舟、山岡鐵舟為代表，前去媾和，以江戶開城為條件，換饒德川慶喜一命，史稱「江戶無血開城」。
另一方面，會津藩藩主松平容保被列為朝敵，新政府軍下令米澤、仙臺等東北諸藩前去征討會津，東北諸藩懇請新政府赦免會津被拒，於是決意奮起抵抗，刺殺強硬派世良修藏等人，同時說服奧羽一帶舊幕府諸藩，組成奧羽越列藩同盟，共抗新政府軍。雙方交兵數月，米澤藩、仙臺藩先後投降，會津藩主城會津若松城被圍，孤城難支，最終開城投降。
就在江戶開城之時，原任幕府海軍副總裁的榎本武揚，仍主張徹底抵抗，不願將軍艦轉交新政府，持續在沿海支援殘存之幕府軍。米澤藩投降後，榎本武揚率艦駛向蝦夷地，攻破當地新政府軍，以箱館五稜郭為根據地，另建政權（今又稱蝦夷共和國），同時向新政府請願，希望能將蝦夷地劃給舊幕臣。新政府拒絕，派兵往討。1869年5月，榎本武揚兵敗投降。
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